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碱变性法是最常见的革兰氏阳性细菌质粒DNA提取方法，其过程是首先菌体经离心悬浮后，细胞被SDS和碱裂解，并且碱使基因组DNA和革兰氏阳性细菌质粒DNA变性，随后用酸中和，革兰氏阳性细菌质粒DNA可以快速复性，而基因组DNA不能快速复性，故可以通过离心去除。如果用柱式法，则含革兰氏阳性细菌质粒DNA的上清用离心吸附柱吸附革兰氏阳性细菌质粒DNA，洗去杂质，得到纯化的革兰氏阳性细菌质粒DNA。但此方法不适合特别大的质粒。因此本公司推出沉淀法，用于纯化柱式法不能回收的革兰氏阳性细菌质粒DNA。

• 快速、步骤少，整个操作在40分钟左右完成。
  
• 革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化溶液B中有蓝色染料，便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状况，保证实验效果。
  
• 产量高，一次可以处理1～5mL过夜培养的菌液，每毫升过夜培养的菌液可以提取到2～5μg/mL（取决于质粒是高拷贝、中拷贝还是低拷贝）。
  
• 本制品足够50次微量提取。
  
• 纯度高，采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8～2.0之间，可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。

• 从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养12～16小时（摇床转速200～300）。
  
  • 建议使用LB培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统的处理能力从而降低革兰氏阳性细菌质粒DNA的质量。
    
  • 另外，延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成革兰氏阳性细菌质粒DNA浓度降低。
• 用1.5mL离心管收集1～5mL过夜培养饱和菌液，室温12000×g离心1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
  
• 第一次使用本试剂盒时，先将本试剂盒提供的全部RNase A溶液加入到纯化溶液A中，摇匀后再取用，未用完的溶液A放4℃保存。
  
• 加入250μL溶液A到第2步得到的细菌沉淀中，用枪头充分吹打使菌体重悬。
  
  细胞未充分悬浮会影响后续碱变性，可以使用漩涡振荡器混匀或使用枪头吸头吹打沉淀至完全混匀。
  
  
• 加入大约5mg溶菌酶干粉到细菌悬液中（用0.1mg精度的分析天平称量），轻柔颠倒混匀后室温放置10分钟破裂细胞壁。
  
• 加入250μL纯化溶液B，温和颠倒4～6次混匀，蓝色将变得均匀并且溶液将变得粘稠。
  
  • 千万不要剧烈振荡，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染革兰氏阳性细菌质粒DNA。
    
  • 如果纯化溶液B在低温放置产生沉淀，须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用。
    
  • 纯化溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和纯化溶液B中的碱，降低其效率。如果溶液B颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且跟厂家联系。
• 冰上放置不超过5分钟。
  
  冰上放置不要超过5分钟，否则革兰氏阳性细菌质粒DNA会有碱损伤。
  
  
• 加入350μL冰上预冷的纯化溶液C，温和反复颠倒4～6次，溶液将变成无色，将有白色絮状沉淀产生。
  
• 冰上放置至少5分钟让革兰氏阳性细菌质粒DNA复性。不能短于5分钟，一般10分钟。
  
• 12000×g离心3分钟，小心将上清液转移到新离心管中。
  
  • 由于此时的溶液比重较大，部分絮状物悬浮在上清液中属正常现象，吸取上清时避开这些悬浮物即可。
    
  • 如果此步的离心在4℃进行，可减轻沉淀物漂浮。
• 加入0.6mL去蛋白溶液，充分震荡2分钟后常温12000×g离心2分钟，取水相（无色）到新离心管中，不要取有颜色的部分。
  
• 加等体积的质粒沉淀液，颠倒30秒混匀后室温12000×g离心10分钟，革兰氏阳性细菌质粒DNA将形成沉淀，弃上清。
  
• 加入1mL的自备75%乙醇，室温12000×g离心1分钟，弃上清。
  
• 室温12000×g离心1分钟，取出残留液体（约50μL）。
  
• 室温短暂放置半分钟。
  
• 加入DNA洗脱液50～100μL重悬沉淀，即得革兰氏阳性细菌质粒DNA溶液，可以直接用于后续实验。